Денис Владимирович Пушилин родился 9 мая 1981 года в городе Макеевка Донецкой области Украинской ССР.
В 1998 году окончил Макеевский городской лицей.
В 1999-2000 годах проходил службу в Национальной гвардии Украины на территории Крыма.
По окончании срочной службы Пушилин поступил в Донбасскую национальную академию архитектуры и строительства на факультет "Экономика предприятий".
С 2002 года учебу начал совмещать с трудовой деятельностью.
Занимался общественной деятельностью. Организовал партию "Мы имеем цель", участвовал в выборах в Верховную раду Украины.
После государственного переворота в Киеве в марте 2014 года стал одним из лидеров народно-освободительного движения в Донбассе.
После провозглашения 7 апреля 2014 года Донецкой Народной Республики Денис Пушилин стал сопредседателем временного правительства.
15 мая 2014 года он был назначен председателем президиума Верховного совета самопровозглашенной ДНР.
18 июля 2014 года Пушилин подал заявление об отставке с поста председателя Верховного совета ДНР.
Занимался первыми централизованными гуманитарными поставками из России в Донбасс в качестве сопредседателя "Народного фронта Новороссии".
3 ноября 2014 года Денис Пушилин был избран депутатом Народного Совета ДНР, а 14 ноября стал заместителем председателя Народного совета ДНР.
9 ноября 2014 года указом главы самопровозглашенной ДНР Александра Захарченко был назначен на должность постоянного полномочного представителя ДНР на переговорах Контактной группы в Минске (Белоруссия).
В сентябре 2015 года был избран председателем Народного Совета Донецкой народной республики.
7 сентября 2018 года парламент самопровозглашенной ДНР проголосовал за назначение Дениса Пушилина исполняющим обязанности главы республики. Перед этим парламент республики проголосовал за досрочное снятие полномочий главы ДНР с Александра Захарченко в связи с его смертью.
С конца 2017 года Денис Пушилин руководит Русским центром, созданным в Донецке для активизации и систематизации интеграционных процессов Донбасса с Российской Федерацией. Он также был одним из создателей общественного движения "Донецкая Республика", возглавлял до октября 2017 года его исполнительный комитет.
Денис Пушилин женат, у него три дочери.